Omixon HLA Twin CE - 2.1.4 Gebrauchsanleitung

Table of Contents 1

EINFÜHRUNG

5

1.1

ALLGEMEINE INFORMATION

5

1.2

SEQUENZIERUNGSTECHNOLOGIEN

5

1.2.1

SYSTEMVORAUSSETZUNGEN

5

1.3

VERWENDUNGSZWECK

5

1.4

WARNUNG UND VORSICHTSMASSNAHMEN

6

1.4.1

ANWENDUNGSBESCHRÄNKUNGEN

6

2

WAS IST NEU IN DIESER VERSION?

7

3

KURZANLEITUNG

8

3.1

ANMELDUNG

8

3.2

HLA TYPING DASHBOARD

8

3.2.1

HOLOTYPE HLA TYPING - E MPFOHLEN FÜR HOLOTYPE PROBEN

9

3.2.2

ERGEBNISSE

9

3.3

ERGEBNISSE DER ANALYSE DER HLA-TYPISIERUNG

10

3.4

HLA BROWSER

13

3.5

SETTINGS DASHBOARD

14

3.6

ALLGEMEINE INFORMATIONEN

14

3.7

KONFIGURATION

14

3.8

ADMINISTRATION

14

3.9

EXPORT

15

4

INSTALLATIONSANLEITUNG

16

4.1

WINDOWS

16

4.1.1

INSTALLATIONSCHRITTE

16

4.2

LINUX

16

4.2.1

INSTALLATIONSSCHRITTE

17

4.3

MAC OS X

17

4.3.1

INSTALLATIONSSCHRITTE

18

5

OMIXON HLA SERVER

19

5.1

INSTALLATIONSANLEITUNG

19

5.2

STARTEN DES SERVERS

19

5.2.1

LINUX

19

5.2.2

WINDOWS

20

5.3

KONFIGURIEREN DES SERVERS

20

5.3.1

MODIFIZIERUNG DER KONFIGURATION

20

5.4

AKZEPTIEREN VON CLIENTVERBINDUNGEN

21

5.4.1

VERBINDEN DES CLIENTS

21

5.4.2

EXPORTIEREN UND IMPORTIEREN VON VERBINDUNGSKONFIGURATIONEN

22

5.5

DER SUPER-USER

23

5.6

DATENVERWALTUNG

23

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1 Einführung 1.1 Allgemeine Information Omixon HLA Twin bietet zwei unabhängige Algorithmen für die NGS-basierte HLA-Typisierung: Die statistische Genotypisierung (SG) und die Consensus-Genotypisierung (CG). Diese Algorithmen wurden speziell für das Holotype HLA-Sequenzierungssystem von Omixon entwickelt. Die zwei Algorithmen können gleichzeitig laufen und die Ergebnisse werden in einer Tabelle zusammengestellt. Zusätzlich enthält diese Übersichtstabelle ausführliche Angaben zur Statistik und Qualitätskontrolle für jede Probe. Omixon HLA Twin bietet zwei unterschiedliche Lizenzformen:

1. Eine zeitabhängige Lizenz, die für einen vorgegebenen Zeitraum HLA Typisierungen uneingeschränkterlaubt. Wenden Sie sich bitte an [email protected] für ein Angebot. Die Testversion enthält eine Lizenz mit 90 Tagen Gültigkeit.

1.2 Sequenzierungstechnologien Omixon HLA Twin unterstützt die Auswertung von Sequenzdaten folgender Hersteller: Illumina

1.2.1 Systemvoraussetzungen Die empfohlene Mindestanforderung des Programms an die Hardware sieht folgendermaßen aus: Desktop

Server

Client

CPU

64 bit multi-core

64 bit multi-core

64 bit multi-core

Speicher (Minimum /empfohlen)

12GB/16GB

12GB/16GB

4GB/8GB

Betriebssystem

64 bit Windows/Linux or OS X

64 bit Windows or Linux

64 bit Windows/Linux or OS X

(OS X not supported) Der Speicherplatzbedarf hängt von der Anzahl und Größe der Probendateien ab und ist im Hinblick auf die geltenden Anforderungen für Datenspeicherung, das Mindestmaß an Backup und Redundanz, sowie des zu erwartenden Jahresvolumens zu berechnen. Omixon kann Ihnen bei der Berechnung des Speicherbedarfs assistieren. Bitte kontaktieren Sie [email protected] wenn Sie Hilfe benötigen.

1.3 Verwendungszweck Omixon HLA Twin ist konzipiert zur Interpretation von NGS-Daten der Omixon Holotype HLA Sequenzierungs-Kits, die auf einem MiSeq von Illumina generiert wurden. Diese liefert höchstpräzise Ergebnisse auf Einzelallelebene mit sehr niedrigen Ambiguitätsraten bei einer 2-Felderauflösung. Die Software liefert Informationen zu den humanen Histokompatibilitätsgenen der HLA-Klasse I (A, B und C) und Klasse II (DPA1, DPB1, DQA1, DQB1 und DRB1/3/4/5) basierend auf zwei unabhängige Algorithmen: Die statistische Genotypisierung (SG) und die Consensus-Genotypisierung (CG). Die beiden Algorithmen können gleichzeitig laufen, wobei deren Konkordanz Gebrauchsanleitung

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Consensus-Genotypisierung (CG). Die beiden Algorithmen können gleichzeitig laufen, wobei deren Konkordanz immer neben dem Ergebnis des primären Genotypisierungs-Algorithmus angezeigt wird, wenn beide Methoden gelaufen sind. Zusätzlich enthält diese Übersichtstabelle ausführliche Angaben zur Statistik und Qualitätskontrolle für jede Probe. Die Omixon HLA TWIN Software ist für den in vitro diagnostischen Gebrauch durch professionelles Personal wie Labortechniker und Ärzte bestimmt, die für die HLA-Typisierung in diagnostischen Laboratorien mit EFI- oder ASHIAkkreditierung geschult wurden oder zur Arbeit gemäß EFI- oder ASHI-Spezifikationen fähig sind. Die von der Software generierten Ergebnisse dürfen nicht als alleinige Basis für klinische Entscheidungen verwendet werden!

1.4 Warnung und Vorsichtsmaßnahmen 1.4.1 Anwendungsbeschränkungen Die Algorithmen wurden zusammen mit dem HLA Holotype-HLA- Sequenzierungs-Kit von Omixon entwickelt und extensiv validiert. Für die optimale Funktion verwenden Sie bitte die Software zusammen mit dem Omixon HLA Holotype-Kit zur NGS HLA Typisierung auf einem MiSeq-System von Illumina. Bei Verwendung anderer HLASequenzierungs-Kits und NGS-Plattformen als oben erwähnt müssen diese vom Benutzer extensiv zu verifiziert und zu validiert werden!

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2 Was ist neu in dieser Version?

Eine detaillierte Übersicht aller vorheriger Versionen finden Sie im Kapitel “Entwicklungsverlauf” im Omixon Handbook!

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3 Kurzanleitung 3.1 Anmeldung Nach der Lauf-Initialisierung der HLA-Software muss sich der Benutzer in der Anwendung anmelden. Geben Sie Benutzernamen und Passwort in die entsprechenden Felder ein und klicken Sie auf „Login“. Für die erste Anmeldung wurde ein Superuser entwickelt.

3.2 HLA Typing dashboard Nach der Anmeldung in der Software wird das „HLA-dashboard“ sichtbar. Dieses ist das Home-Dashboard der Software. Alle HLA Typisierungsfunktionen sind von hier an verfügbar. Das Dashboard besteht aus folgenden Untereinheiten: „information panel“: dieses enthält alle Hauptfunktionen sowie einige wichtige Informationen über den aktuellen Ordner und die ausgewählten Dateien. Zusätzlich zeigt es Informationen über den aktuellen Benutzer sowie die aktive IMGT/HLA Datenbank an und bietet einige Navigationsfunktionen. „File Browser“: dieser Teil des Bildschirms kann zur Navigation zwischen allen verfügbaren Ordnern verwendet werden. Das „information panel“ befindet sich im oberen Bereich des Bildschirms. Es hat drei verschiedene Abschnitte: Der obere Teil des „information panel“ zeigt Ihnen: die ID des aktuellen Benutzers, die „memory usage“ Anzeige das Statusfeld des „process manager“, die „welcome-tutorial“- Schaltfläche, die „logout“-Schaltfläche, und die „exit“-Schaltfläche. Der mittlere Teil des „information panel“ zeigt Ihnen: Navigationsschaltflächen: „Back“, „Forward“, „Up“ und „Home“. Die „Home“-Schaltfläche bringt Sie zurück zum „HLA Typing dashboard“. Rechts der Navigationsschaltflächen können Sie die verfügbaren Informationen zur verwendeten IMGT /HLA-Datenbank sehen. Auf der rechten Seite des Bildschirms können sie die bookmark und die inhaltsspezifischen „help“Schaltfläche. Der untere Teil des „information panel“ bietet eine Vielzahl von Schaltflächen, die es Ihnen ermöglicht zwischen den Hauptfunktionen dieses Dashboards zu wählen: „Typing and data analysis“ Optionen für die HLA-Typisierung „Typing and data analysis“ Optionen zur Visualisierung der Ergebnisse „File browser“ Funktion zur Navigation zwischen Proben und Ordnereinstellungen der Anwendung Der Hauptabschnitt des Displays ist der Dateien Browser, in dem sie durch Klicken auf das Laufwerk und den Ordnernamen navigieren können – wie in einem herkömmlichen Dateien-Browser. Benutzen Sie den Browser um zu dem Ordner zu navigieren, an dem Ihre Genotypisierungs-Proben gespeichert sind.

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Sobald Sie den Ordner, in dem Ihre Daten sind, im „File Browser“ Abschnitt ausgewählt haben, können Sie Ihre Daten sehen. Jede Probe ist durch ein kleines DNA-Symbol markiert und besitzt einen eigenen Namen, welcher identisch ist zu dem Namen, der durch das Sample sheet erstellt wurde. Für paired reads paart die Software die Dateien basierend auf ihrem Namen automatisch, sodass nur die "R1" FASTQ Datei im Dateienbrowser angezeigt wird, wodurch die Redundanz und Hilfe-Navigation vermindert wird. Wenn Sie mit der Maus über die Datei der Probe fahren, können Sie die Größe der individuellen FASTQ Dateien sehen Falls eine Probe bereits analysiert wurde, wird eine separate Datei, die HLA Typisierungsergebnis Datei, im Dateienbrowser angezeigt. Die Ergebnisdatei hat die .htr-Endung. Als Voreinstellung werden alle Ergebnisdateien automatisch in demselben Ordner wie die Rohdaten abgelegt. Jede Analyse wird durch ein kleines Tabelle-Zeichen markiert. Der Name der Analyse-Datei besteht aus dem Probennamen sowie einem Zeitstempel, der zu der Zeit passt, an der die Analyse gestartet wurde. Wenn Sie mit der Maus über die Analyse-Datei fahren, können Sie jede verfügbare Information über die Analyse sehen. Wenn Sie sich eine .htr Datei ansehen, können Sie ganz rechts die Qualitätsniveauübersicht der HLA Typisierungsergebnisse sehen. Die Ergebnisse werden durch ein “Ampelsystem” mit Erläuterungen versehen. Analog zu einer eigentlichen Ampel, werden drei unterschiedliche Farben mit verschiedenen Bedeutungen verwenden. Anders als bei einer eigentlichen Ampel, gibt es zusätzlich gemischte Farben. Die „HLA typing functions“ sind ausgestellt – Schaltflächen grau hinterlegt – solange keine Proben im Bildschirm angezeigt werden. Sobald Sie eine FASTQ Datei (oder jedes andere unterstütze Format) auswählen, sind mehr Schaltflächen verfügbar. Um eine Analyse zu starten, folgen Sie dem Analyse-Abschnitt. Sie finden detaillierte Informationen über diesen Bildschirm und alle verfügbaren Funktionen in dieser Bedienungsanleitung in dem Omixon Handbuch/HLA Typing Dashboard-Abschnitt. Analyse Sobald mindestens eine Probe eingefügt wurde, haben Sie viele Optionen die HLA Typisierung zu starten.

3.2.1 Holotype HLA Typing - e mpfohlen für Holotype Proben Die HLA-Typisierung mit voreingestellten Parametern kann durch einen einzigen Klick auf die „Analyse“Schaltfläche, die in jeder Spalte jeder Probe zu sehen ist, gestartet werden. Zur Typisierung mehrerer Proben drücken Sie zunächst die Strg oder Umschalt-Taste, um die Proben auszuwählen, und im Anschluss starten Sie die Typisierung entsprechend dem Holotype Protokoll durch Drücken der „Holotype Typing“-Schaltfläche, die erste im oberen Menü. Ob die Typisierung läuft, können Sie über den „Process manager“, der sich in der oberen rechten Ecke befindet, überprüfen. Sie können detaillierte Informationen zu dieser oder anderen verwandten Funktionen, wie HLA Typisierung mit kundenspezifischen Parametern und die Reanalyse von Proben, in dem Benutzerhandbuch/HLA Typing Dashboard-Abschnitt finden.

3.2.2 Ergebnisse Sobald die Typisierung im „Process manager“ 100 % erreicht hat, erscheint eine neue Ergebnisdatei im Dateienbrowser. Falls mehrere Proben auf einmal typisiert wurden, wird für jede Probe ein Ergebnis erscheinen, sobald die Probe fertig analysiert ist – Sie können sich die ersten Ergebnisse bereits ansehen, während der Rest noch in Bearbeitung ist. Die Ergebnis-Dateien zeigen für einen schnellen Überblick ein Ampellicht, zur Anzeige weiterer Details können Sie auf die „View“-Schaltfläche am Ende von jeder Reihe klicken. Zur Anzeige mehrere Ergebnisse drücken Sie die Strg oder Umschalt-Taste, um die Proben auszuwählen, und im Anschluss die „View results“-Schaltfläche im oberen Teil des Menüs. Sie finden detaillierte Informationen zur Interpretation der Ergebnisse in dem Benutzerhandbuch/ HLA Typing Analysis Ergebnis- und User guide/HLA Typing Sample ErgebnisAbschnitt. Gebrauchsanleitung

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3.3 Ergebnisse der Analyse der HLA-Typisierung Wie bereits in dem Ergebnis Abschnitt erwähnt, können Sie Ihre Ergebnisse sichtbar machen, indem Sie eine oder mehrere Proben hervorheben und die „View results“-Schaltfläche klicken. Dies wird Sie zum nächsten Abschnitt der HLA Twin navigieren: Die Ergebnisse der Analyse der HLA-Typisierung. „information panel“ – beachten Sie, dass die Struktur dieses Panels größtenteils identisch zu dem HLA Typing dashboard „information panel“ ist (für Details siehe oben)

Results Table, eine Überblick-Tabelle, welche aus den Ergebnissen der vorherigen markierten Proben besteht. Der untere Teil des „information panel“ beinhaltet eine Vielzahl von Schaltflächen, welche es Ihnen erlaubt zwischen den Hauptfunktionen dieses Dashboard zu wählen. „Sample details“ and „browse alignment“ “Display setup”-Schaltflächen “Assignment”-Schaltflächen

Export table Weitere Optionen: „comment sample”, „approve sample”, „cancel the approval of a sample” und „show Linkage Disequilibrium” In der Ergebnis-Tabelle der Analyse der HLA-Typisierungsergebnisse können Sie einen detaillierten Überblick Ihrer Ergebnisse für jeden Locus jeder Probe sehen. Die Tabelle besteht aus folgenden Spalten:

Approval Zeigt an, ob eine Probe zugelassen wurde, bereit ist zur Zulassung oder immer noch bearbeitet wird.

Sample Beinhaltet den Namen der .htr-Datei, die auf Basis des Probennamen und dem Zeitstempel für den Zeitpunkt, an dem die Analyse gestartet wurde, generiert wurde. Falls eine Probe mehrmals analysiert wurde, folgt die Anzeige der Proben der Reihenfolge der Analyse. Sie können den Zeitstempel verwenden, um die verschiedenen Analysezeiten zu unterscheiden.

Allele Zeigt die beiden Allele Allel 1 und Allel 2 in verschiedenen Reihen Getrennte Spalten für die analysierten Loci Am linken Ende der angezeigten Ergebnisse können Sie ein kleines Häkchen sehen, welches anzeigt ob Sie das „Best matching allele“ sehen. Sie können das Ergebnis durch das Klicken auf die Checkbox zuweisen. Das Feld wird grün und signalisiert dadurch, dass das Ergebnis zugewiesen wurde. Neben dem Häkchen sehen Sie die Ampel: Konkordanz-Ampel: Das Konkordanz-Ampelsystem liefert folgende Ergebnisse: (grün): Ergebnisse der SG und CG sind vollständig konkordant (im 3.Feld), (gelb): Ergebnisse der SG und CG sind konkordant bis zur 4. Stelle (im 2. Feld), (rot/gelb): Ergebnisse der SG und CG sind konkordant bis zur 2. Stelle (im 1. Feld),

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(rot): Ergebnisse der SG und CG sind diskordant.Note, that concordance traffic lights are only presented for best matching alleles. Beachten Sie, dass die Konkordanz-Ampeln nur für die am besten passenden Allele vorhanden sind. Die zweite Ampel basiert auf der Qualitätskontroll(QC)-Messung auf Locusebene. Qualitätskontroll-Ampel: Diese Lichter basieren auf der Qualitätskontroll(QC)-Messung auf Locusebene. (grün) - PASSED: der Locus hat alle QC-Tests bestanden, (gelb/grün) - INFO: ein oder mehrere QC-Tests ergaben unterdurchschnittliche (gelb) - INSPECT: ein oder mehrere QC-Tests ergaben verdächtiges Ergebnisse, manuelle Überprüfung der Ergebnisse notwendig, (rot/gelb) - INVESTIGATE: ein oder mehrere QC Tests zeigen Ergebnisse schlechter Qualität, manuelle Überprüfung und eventuelle Reanalyse notwendig, (rot) - FAILED: ein oder mehrere QC Tests zeigen Ergebnisse sehr schlechter Qualität, manuelle Überprüfung ist nötig, um den Grund zu ermitteln und der Locus oder die Probe muss voraussichtlich wieder sequenziert oder durch alternative Methoden retypsiert werden. Es können auch andere Symbole für Allele vorhanden sein: Allele mit blauer Schrift sind homozygot. Seltene Allele sind mit einem Ausrufezeichen-Symbol markiert

.

Neue Allele die Exon (oder Exon und Intron)- Neuheiten beinhalten, sind mit , markiert, wohingegen neue Allele, die nur Intron-Neuheiten enthalten, mit markiert sind. Ungleichmäßig detektierte Allele werden in Kursivschrift angezeigt. Allele mit erweiterter Allelsequenz sind durch ein Pluszeichen markiert

.

Wenn ein minor Allel mit einer bekannten niedrigen Amplifikation in der „imbalanced minor allele“-Liste ist, wird das Allele mit markiert. In diesem Fall wird eine Validierung des homozygoten Ergebnisses mit einer alternativen HLA-Typisierungsmethode (z.B. SSO) stark empfohlen.. Hemizygote Allele sind mit markiert. Falls ein Locus hemizygot ist, wird lediglich ein Allel gezeigt, die andere Zelle bleibt leer. Falls die Zygotie eines Locus anhand der Daten nicht bestimmt werden kann, werden die Allele mit markiert. Wenn Sie mit der Maus über die unterschiedlichen Bereiche der Tabelle fahren, öffnet sich ein Pop-up Fenster, welches weitere verfügbare Informationen zu den Bereichen anzeigt. Von dem „HLA Typing Analysis dashboard“ aus können Sie zu dem „HLA Typing Sample Result“ oder direkt zu dem „Genom Browser“ gelangen. In dem „HLA Typing Sample Results“ können Sie die detaillierte Qualitätsmetrik der analysierten Proben sehen. Um dorthin zu gelangen, markieren Sie die gewünschte Probe und klicken auf die „Sample Details“-Schaltfläche in der unteren Reihe des oberen Bereichs. Im Genom-Browser können Sie die detaillierten Ergebnisse für jeden typisierten Locus sehen. Um dorthin zu gelangen, markieren Sie die Proben, die Sie sehen möchten, und klicken Sie auf die „Browse Alignment“Schaltfläche in der unteren Reihe des oberen Bereichs. Für weitere Informationen schauen Sie in den „HLA Typing Analysis Result“-Abschnitt des Omixon Handbuchs. HLA Typing Sample results Im „HLA Typing Sample Results“-Bereich können Sie die Details der Ergebnisse der Genotypisierung, die Qualitätsmetrik und die Datenstatistik für jeden Locus der ausgewählten Probe überprüfen. Der „HLA Typing Sample Results“-Bereich kann in zwei größere Teile unterteilt werden: Gebrauchsanleitung

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„information panel“ - beachten Sie, dass die Struktur dieses Panels größtenteils identisch zu dem HLA Typing dashboard „information panel“ ist (für Details siehe oben) „Details Panel“ welches die Genotypisierungs-Ergebnisse, die detaillierte Qualitätsmetrik und die Datenstatistik zeigt. Der untere Teil des „information panel“ zeigt eine Vielzahl von Schaltflächen, die es Ihnen ermöglichen zwischen den Hauptfunktionen dieses Dashboards zu wählen: Opening the browser Detailed genotyping information Customizing displayed results Assigning alleles Commenting In dem Details Panel können Sie zwischen drei verschiedenen Tabs wählen, die Sie sich ansehen möchten: „Genotype“ Im Genotyp Abschnitt können Sie den Genotyp anschauen, den die Software ausgewählt hat. Sie können Allele manuell hinzufügen/entfernen. „Quality control“ Mehrere Qualitätkontroll-Messungen werden für jeden Locus berechnet. Jede Messung für jeden Locus wird mit einem Ampelsystem markiert. Die Tabelle der Qualitätskontrolle besitzt eine Spalte für die Metrik und eine getrennte Spalte für alle der gezeigten Loci. Die „Overall“-Reihe zeigt das gesamte Ergebnis basierend auf dem Ampelsystem für jeden der individuellen Loci. Jede Metrik besitzt ihre eigene Reihe in der Tabelle. Gleich neben dem Namen der Metrik, wird ein kleines „i“-Symbol angezeigt. Wenn Sie mit der Maus über das „i“-Symbol der fahren, erscheint ein Pop-Up Fenster, welches eine detailliertere Beschreibung der ausgewählten Metrik zeigt. Für jede Metrik können Sie das Ampel-Symbol, den Metrikwert und das „i“-Symbol mit Informationen über den spezifischen Schwellenwert für die Metrik, sehen. Wenn Sie mit der Maus über das „i“-Symbol fahren, erscheint ein Pop-Up Fenster, welche detailliertere Informationen über den Schwellenwert der ausgewählten Metrik zeigt. „Data Statistics“ “Overview“-Bereich - Read counts und Verhältnisse sind für mehrere verschiedene Schritte der Analyse verfügbar. „Allele imbalance“-Bereich – Diese Grafik zeigt das allelische Ungleichgewicht pro Region für alle Gene. „Fragment size“-Bereich – Das Histogramm zeigt die Fragmentgrößen-Verteilung der paired-reads. „Read quality“-Bereich – In dieser Grafik wird die Basen-Qualität pro fünf Basen der bearbeiteten reads gezeigt. Read-Positionen werden auf der x-Achse dargestellt, wohingegen Qualitätswerte auf der y-Werte gezeigt werden. Die unterschiedlichen Loci können auf der linken Seite des unteren Abschnitts ausgewählt werden. Für die ausgewählten Loci können Sie in dem Genom-Browser durch Klicken der "Browse Alignment"-, "Browse Allele 1"-, "Browse Allele 2"-Schaltflächen zwischen ihnen wechseln. Für weitere Informationen, schauen Sie in der „HLA Typing Sample result“-Abschnitt des Omixon Handbuchs.

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3.4 HLA Browser Der HLA Browser erlaubt Ihnen eine visuelle Überprüfung der genomischen Daten. Mit den Standardeinstellungen sind folgende Wege im Browser verfügbar: „Position track“ – zeigt die Koordinaten für alle sichtbaren Wege. Die Nummerierung startet bei eins. „Phasing track group“: „Phasing track“ – Dieser Weg enthält Kommentare für durchgehende phased regions (aka Phasing regions). „Variants track“ – Zeigt die Nummer an überlappend read-Paaren zwischen zwei aufeinanderfolgenden heterozygoten Positionen (z.B. zwei Positionen, an denen sich zwei Consensus Sequenzen voneinander unterscheiden). Die Kennzeichnung „Straight” zeigt im Browser für jede Consensus-Sequenz die Anzahl der reads, die für das Phasing verwendet wurden, wohingegen die Beschriftung “Cross” die Anzahl der verwendeten reads für das alternative Phasing der beiden Positionen anzeigt.

Consensus sequence 1 – Die generierte Consensus-Sequenz für eines der beiden Chromosomen. Coverage depth for Consensus 1 – Zeigt die Coverage für jede Position der errechneten ConsensusSequenz 1. Consensus sequence 2 – Die generierte Consensus-Sequenz für das andere Chromosom. Coverage depth for Consensus 2 – Zeigt die Coverage für jede Position der errechneten ConsensusSequenz 2. Allele 1 sequence – Nukleotid-Sequenz für das am Allel, welches am besten zu der ersten ConsensusSequenz passt. Region annotation for allele 1 – Kommentare für Exons, Introns und UTRs werden für Allel 1 gezeigt. Coverage depth track for allele 1 – Zeigt die Coverage für jede Position des Alignments des ersten Allels. Allele 2 sequence - Nukleotid-Sequenz für das am Allel, welches am besten zu der zweiten ConsensusSequenz passt. Region annotation for allele 2 - Kommentare für Exons, Introns und UTRs werden für Allel 2 gezeigt. Coverage depth track for allele 2 - Zeigt die Coverage für jede Position des Alignments des zweiten Allels. Für neue Allele werden zwei Referenzspuren angezeigt: Die Referenzsequenz des neuen Alleles (Novel ref) und die Referenzsequenz des am nächsten verwandten Alleles (Rel ref), von welcher sich das neue Allel ableitet. Beachten Sie, dass die Consensus-Sequenz und die zugehörigen kurzen reads im Browser angezeigt werden können, sogar wenn keine passenden Allelpaare gefunden wurden. Zusätzliche Funktion: „Noise“-Funktion – zeigt den Hintergrund systematisch an, der während der Consensus-Generierung herausgefiltert wurde. Der noise Consensus enthält die wichtigsten Nukleotide für jede Position „Amino acid“-Funktion – zeigt die Aminosäuresequenz für alle Allele und die Consensus-Sequenz, welche neue Allele beinhaltet, an. In den Standardeinstellungen werden detaillierte „Coverage“-Funktionen für alle Allel-Alignments angezeigt, daneben befinden sich Kommentare zu den Regionen. Die „Coverage“-Funktion verfügt über eine eingebaute visuelle Darstellung der Basenstatistik: Für den Anteil der reads, bei denen sich Nukleotide von den aktuellen Consensus/Referenz-Basen unterscheiden, wird die zugehörige Coverage relativ zu der Gesamt-Coverage mit der spezifischen Basenfarbe angezeigt. Zusätzliche Modi für „short read“-Funktionen Im Gegensatz zum voreingestellten „Coverage depth“-Modus, sind die folgenden alternativen „short reads“Anschauungsmodi für die „short read“-Funktionen verfügbar:

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„Short read mode“ – zeigt die short reads strangweise an, so dass forward reads (pink) und reverse reads (gelb) innerhalb des Bildschirms leicht voneinander unterschieden werden können. „Fragment mode“ – Gepaarter Anzeigemodus, der die zugehörigen forward und reverse reads in Paaren in derselben Zeile anzeigt. Überlappende Bereiche zwischen den read Paaren sind blau markiert, wohingegen nicht überlappende reads durch eine dünne Linie miteinander verbunden sind. In beiden oben beschriebenen Modi kann die „short read“-Funktion minimiert werden, wodurch eine Übersichtsansicht der short reads generiert wird (erlaubt keine Detail-Ansicht der einzelnen reads).

3.5 Settings dashboard Das „Settings dashboard“ kann von dem HLA Typing dashboard erreicht werden, indem Sie die „Application settings“-Schaltfläche drücken. Das Einstellungs-Dashboard zeigt Ihnen einen Überblick der Einstellung in dem Programm erlaubt Ihnen Zugriff auf administrative Funktionen sowie Änderungen von Einstellungen und beinhaltet zusätzlich einige „log export“-Funktionen. In diesem Dashboard sind zusätzlich einige allgemeine Informationen über die aktuelle Version der Software und den aktuellen Benutzer verfügbar.

3.6 Allgemeine Informationen Es gibt drei Blöcke an Informationen im Setting Dashboard: Omixon HLA Edition: dieser Teil beinhaltet die aktuelle Version der Software, der „build identifier“- mit der „copy to clipboard“-Funktion sowie Informationen zu Kontakt und Copyright. „User info“: dieser Teil beinhaltet den Login-Namen sowie Vor- und Nachname des aktuellen Benutzers. „License info“: dieser Teil zeigt die Anzahl der verfügbaren Credits sowie das Ablaufdatum der Lizenz.

3.7 Konfiguration In diesem Funktions-Abschnitt können Sie Protokolle erstellen und verwalten sowie die Bildschirm-Einstellungen des HLA Browsers und des „result“-Bildschirms ändern. Beachten Sie, dass diese Änderungen die Standardeinstellungen und das Design der Software verändern. Für weitere Details zu den Protokollen schauen Sie auf der „Protocols help“-Seite. Falls Sie lediglich eine temporäre Änderung der Browsereinstellungen vornehmen möchten, sollten Sie die „Display settings“-Option im Browser-Fenster verwenden. Sie können zusätzlich die Standardfilter des „HLA result“-Bildschirms verändern. Beachten Sie, dass falls sie einen Locus in diesem Fenster abwählen, können keine Ergebnisse mehr für diesen Locus angezeigt werden, unabhängig von den Typisierungsergebnissen. Für beide Einstellungen können Sie alle Parameter wieder auf die Standardwerte zurücksetzen, wenn Sie die „Restore defaults“-Funktion benutzen. Für weitere Details zu diesen Einstellungen, schauen Sie bitte auf folgenden Hilfeseiten: „Configure HLA Result Display“ und „Genome Browser Setup“.

3.8 Administration Diese Gruppe von Funktionen beinhaltet wenig verwendete, aber sehr nützliche Optionen. Mit der „Install HLA database“-Funktion können sie eine oder mehrere Versionen der IMGT/HLA Datenbank zur HLA Typisierung einrichten. Mit der „Select active database“-Funktion können Sie die aktive Version der Datenbank bestimmen. Die HLA Typisierung wird immer mit der aktiven Version gestartet werden. Falls sie eine installierte Datenbank entfernen möchten, können Sie die „Remove HLA database“-Funktion benutzen, welche es Ihnen erlaubt jede installierte Datenbank zu löschen, die gerade nicht als aktiv ausgewählt ist. Mit der „Configure targeted HLA genes “-Funktion können Sie einstellen, welche Loci sequenziert wurden. Mit Hilfe der „User management- Option können Sie Benutzer hinzufügen, verändern oder entfernen. Mit der „Display hardware key“-Option können Sie sich eine alphanumerische Kennung für Ihren Computer anzeigen lassen, welche zur spezifischen Lizenzgenerierung des Geräts benutzt werden kann. Die „Upload license“-Option kann zum manuellen Importierern von Lizenzdateien in die Software verwendet werden.

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3.9 Export Mit dieser Funktion können Sie die log Dateien der Omixon HLA Software exportieren.

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4 Installationsanleitung Unsere Software kann auf folgenden Betriebssystemen installiert werden Windows Linux Mac OS X

4.1 Windows Wir bieten ein Installationspaket für das Windows-Betriebssystem mit Java-Laufzeitumgebung (JRE) an. Die Omixon HLA-Software wurde mit 64-bit Windows 7, Windows 8/8.1 und Windows 10 getestet.

4.1.1 Installationschritte Starten Sie die .exe-Datei – Ein „Welcome the setup”-Fenster erscheint Wenn HLA Twin bereits installiert wurde, wählen Sie im Installationsfenster „Yes, update the existing installation“ Wenn eine Neuinstallation durchgeführt werden soll, wählen Sie im Installationsfenster „No, install to a different directory“ Nachdem Sie eine Auswahl getroffen haben, klicken Sie auf „next“ Akzeptieren Sie die Software-Lizenzvereinbarung, um mit der Installation fortzufahren. Klicken Sie auf „next “ Wählen Sie den Pfad aus, an dem das Programm installiert werden soll. Klicken Sie dann auf „Select data directory“. Permanente Daten werden hier gespeichert. Wenn HLA Twin bereits installiert wurde, ändern Sie den angegebenen Pfad bitte nicht– es muss auf den zuvor verwendeten Datenbankordner verweisen. Nachdem das Verzeichnis ausgewählt wurde, klicken Sie auf „next“ Wählen Sie das Verzeichnis für temporäre Daten aus, klicken Sie auf „next“ Wählen Sie den Startmenüordner Wenn Sie einen Startmenüordner erstellen wollen, setzen sie en Häkchen bei „Create Start Menu folder“ und benennen Sie den Ordner Wenn der Startmenüordner für alle Benutzer sichtbar sein soll, setzen Sie ein Häkchen bei „Create shortcuts for all users“. Klicken Sie auf „next“. Die Installation wird nun gestartet. Die Installation ist beendet. Das „Completing the Omixon HLA Setup”-Dialogfenster weist auf eine erfolgreiche Installation hin. Das Programm kann durch das Anklicken des Icons gestartet werden oder durch das Ausführen der .exe-Datei aus dem Programmverzeichnis. Für weitere Informationen und detaillierte Schritte zur Deinstallation, lesen Sie sich „Extended Installation Guide“Abschnitt im Omixon-Handbuch durch.

4.2 Linux Wir bieten ein Installationspaket für das Linux-Betriebssystem mit Java-Laufzeitumgebung (JRE) an.

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Das Installationspaket besteht aus einzelnen shell scripts, die kompatibel mit einer Vielzahl von LinuxDistributionen sind. Der heruntergeladene Installer hat nicht die Erlaubnis die Installation direkt zu starten. Öffnen Sie das Konsolenfester um mit dem folgenden Befehl die Erlaubnis zu erteilen: Desktop Version:

chmod +x installer_name Danach kann die Installation mit dem folgenden Befehl gestartet werden:

./installer_name

4.2.1 Installationsschritte Starten Sie den „installer shell script“ - Ein “Welcome the setup”-Fenster erscheint Wenn HLA Twin bereits installiert wurde, wählen Sie im Installationsfenster „Yes, update the existing installation“ Wenn eine Neuinstallation durchgeführt werden soll, wählen Sie im Installationsfenster „No, install to a different directory“ Nachdem Sie eine Auswahl getroffen haben, klicken Sie auf „next“ Akzeptieren Sie die Software-Lizenzvereinbarung, um mit der Installation fortzufahren. Klicken Sie auf „next “ Wählen Sie den Pfad aus, an dem das Programm installiert werden soll. Klicken Sie dann auf „next“. Wählen Sie ein Datenverzeichnis aus, an dem die permanenten Daten gespeichert werden sollen. Wenn HLA Twin bereits installiert wurde, ändern Sie den angegebenen Pfad bitte nicht– es muss auf den zuvor verwendeten Datenbankordner verweisen. Nachdem das Verzeichnis ausgewählt wurde, klicken Sie auf „next“ Wählen Sie das Verzeichnis für temporäre Daten aus, klicken Sie auf „next“ Wählen Sie das Verzeichnis für Symlinks aus. Klicken Sie auf „next“ - Die Installation wird nun gestartet. Die Installation ist beendet. Das “Completing the Omixon HLA Setup”-Dialogfenster weist auf eine erfolgreiche Installation hin. Das Programm-Icon befindet sich im Systemmenü. Durch das Klicken auf dieses Icon wird das Programm gestartet und kann anschließend verwendet werden. Für weitere Informationen und detaillierte Schritte zur Deinstallation, lesen Sie sich „Extended Installation Guide“Abschnitt im Omixon-Handbuch durch.

4.3 Mac OS X Da es sich bei Mac OS X ausschließlich um ein 64-bit Betriebssystem handelt und von der Java-Laufzeitumgebung regelmäßig ein Update durchgeführt wird, beinhaltet der Installer keine Java-Laufzeitumgebung (JRE). Das verhindert Konflikte zwischen den verschieden JRE-Versionen, kann aber zu Kompatibilitätsproblemen führen. Die erforderliche JRE-Version ist 1.8. Wenn auf Ihrem Mac kein Java installiert ist, wird es automatisch während der Installation heruntergeladen.

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4.3.1 Installationsschritte Öffnen Sie den Installer, der sich im DMG-Verzeichnis befindet. Klicken Sie auf den “Omixon HLA Installer. app”-Icon Wenn HLA Twin bereits installiert wurde, wählen Sie im Installationsfenster „Yes, update the existing installation“ Wenn eine Neuinstallation durchgeführt werden soll, wählen Sie im Installationsfenster „No, install to a different directory“ Nachdem Sie eine Auswahl getroffen haben, klicken Sie auf „next“ Akzeptieren Sie die Software-Lizenzvereinbarung, um mit der Installation fortzufahren. Klicken Sie auf „next “ Verwenden Sie den voreingestellten Pfad, um das Programm zu installieren. Klicken Sie auf „next“. Verwenden Sie den voreingestellten Ordner für das Datenverzeichnis, in dem die permanenten Daten wie z.B. Ergebnisse gespeichert werden sollen. Wählen sie das Verzeichnis für die temporären Daten aus. Klicken Sie auf „next“. Die Installation wird nun gestartet. Die Installation ist beendet. Das „Completing the Omixon HLA Setup”-Dialogfenster weist auf eine erfolgreiche Installation hin. Omixon HLA ist jetzt in der Programmliste vorhanden. Durch das Anklicken des Omixon-HLA-Icons wird das Programm gestartet und kann anschließend verwendet werden. Für weitere Informationen und detaillierte Schritte zur Deinstallation, lesen Sie sich den „Extended Installation Guide“-Abschnitt im Omixon-Handbuch durch.

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5 Omixon HLA Server Der Omixon HLA-Server erlaubt mehrere Client-Verbindungen gleichzeitig. Es erlaubt Zusammenarbeit und das Teilen von Analyseergebnissen zwischen den Benutzern. Die Client-Server-Version verfügt auch über einen Automatisierungsdienst, der es erlaubt eine automatisierte Typisierung durchzuführen, sobald die Proben generiert werden. Protokolldetails, Verarbeitungsfrequenz, Probenidentifikation und weitere andere Parameter müssen eingestellt werden bevor der Server gestartet werden kann. Zur Unterstützung kontaktieren Sie bitte [email protected].

5.1 Installationsanleitung Omixon bietet zwei unterschiedliche Installer für die Server-Version an: „Server-Installer“ – Beinhaltet einen Server und einen einzelnen Client; „Client Installer“ – Beinhaltet einen Client und eine eigenständige Desktop-Version als Paket Der Server ist gebunden an einen Client. Dadurch ist eine separate Installation des Clients auf dem ServerComputer nicht notwendig. Für das Starten des „Server-Installer“ sind Administratorrechte erforderlich. Wenn kein GUI vorhanden ist, kann der „Server-Installer“ auch über eine Befehlszeile gestartet werden (bitte kontaktieren Sie [email protected] für weitere Details). Die Installation des Clients benötigt keine Systemadministratorrechte. Die Schritte beim Server- und Client-Installationsassistenten sind die gleichen wie bei der Installation an einem Desktop-Computer. In beiden Fällen folgen Sie bitte der Desktop Installationsanleitung Ihres Betriebssystems wie es im vorangegangenen Kapitel dieses Handbuchs beschrieben wurde. Bevor Sie mit der Serverinstallation beginnen, schließen Sie bitte alle anderen Omixon Programme und stellen Sie sicher, dass Sie das passende Installationsverzeichnis sowohl bei einer Neuinstallation als auch bei einem Upgrade ausgewählt haben. Sie können den Client-Installer kopieren und an anderen Rechner anwenden. Ist auf dem Computer bereits eine Desktop-Version installiert, stellen Sie sicher, dass sie eine andere Installation location ausgewählt haben, um zu verhindern, dass die vorhandene Installation nicht überschrieben wird.

5.2 Starten des Servers Wichtige Anmerkung Der Server startet nach der Installation automatisch. Danach wird der Server nach dem Hochfahren des Computers automatisch gestartet. Bevor der erste Client mit dem Server verbunden werden kann, muss der Server konfiguriert werden. Neue Einstellungen werden nach dem Speichern der Konfigurationsdaten und nach einem Start/Neustart des Computers übernommen.

5.2.1 Linux Geben Sie das Installationsverzeichnis an und starten Sie den Server-Daemon durch das Ausführen der .exe-Datei über die Befehlsleiste mit einem der folgenden Argumente. Die verfügbaren Argumente werden aufgelistet, wenn der Server ohne die Eingabe eines Arguments gestartet wird.

Verwendung omixon hla server executable {start|stop|status|restart|force-reload}

Gebrauchsanleitung

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start

stop

status

restart or force-reload

Startet den Server wenn Status „stopped“

Schließt den Server wenn Status „running“.

Gibt momentanen Status wieder.

Startet Server neu oder startet wenn Server nicht läuft.

Autostart ist nicht standardmäßig eingestellt. Um den Autostart einzustellen und zu spezifizieren in welchem Runlevel der Dienst gestartet werden soll, benutzen Sie ein Dienst-Konfigurationsmanager wie “chkconfig“ oder „update-rc.d“.

5.2.2 Windows Um den Omixon-Server zu starten, stoppen und einen Starttyp einzustellen, gehen Sie auf “Systemsteuerung → Verwaltung →Dienste“ und modifizieren Sie die Eigenschaften des Omixon HLA Servers. Standardmäßig ist der Starttyp auf automatisch eingestellt und der Service läuft unter dem System-Benutzer-Account.

5.3 Konfigurieren des Servers Um mit den Voreinstellungen zu starten und eine Verbindung vom Client zum Server aufzubauen, muss nur die IPAdresse des Servers dem Client bereitgestellt werden. Hierfür muss der Client gestartet und auf den „Switch Server“ am unteren Rand des Popup-Fensters geklickt werden. Anschließend kann über „Add new server“ die IP-Adresse im Feld „Server host“ eigegeben werden. Klicken Sie auf „Add“ um die Verbindungseinstellungen zu beenden und danach auf „Connect“ auf der neuen „Server Card“, um eine Verbindung zum Server aufzubauen. Fälle an denen weitere Konfigurationen erforderlich sind: Andere Omixon Serverinstanzen wurden auf dem gleichen Server installiert (zum Beispiel eine ältere Version) – In diesem Fall sollten die voreingestellten Ports geändert werden, um Konflikte zu vermeiden In manchen Linux-Distributionen kann die IP-Adresse nicht automatisch gefunden werden. In diesem Fall sollten die IP-Adresse und die Ports manuell konfiguriert werden wie es unten beschrieben wird.

5.3.1 Modifizierung der Konfiguration Wenn eine manuelle Modifizierung der Konfiguration erforderlich ist, kann es durch das Editieren der ServerKonfigurationsdatei nach der Installation durchgeführt werden. Die Konfigurationsdatei befindet sich im Installationsverzeichnis und hat eine „vmoptions“-Endung. Da der Automatisierungsdienst und der Client auch Konfigurationsdateien mit der “vmoptions”-Endung haben, muss sichergestellt werden, dass nur die Konfigurationsdatei des Servers angepasst wird. Der Name der Konfigurationsdatei setzt sich wie folgt zusammen: "omixon-hla-[Version]-server.vmoptions" Modifikationen werden erst nach dem Neustart des Servers übernommen. Modifications take effect only after restarting the server.

WICHTIG Der letzten Zeile in der vmoptions-Datei muss ein Zeilenvorschub folgen.

Einstellen eines Kommunikation-Hosts und Ports Es kann notwendig sein die Parameter des Hosts und des Ports einzustellen. Die Parametervoreinstellungen sind:

-Domixon.server.host=localhost -Domixon.server.port=4380 Gebrauchsanleitung

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Host

Ändern Sie den “localhost”-Wert für den Parameter: „-Domixon.server.host“. Fügen Sie den Hostnamen (z.B.: twin-server) oder den vollen Domainnamen (z.B.: twin-server.mycompany.com) oder die IP-Adresse des Serverrechners ein.

WICHTIG In der Verbindungskonfiguration des Clients muss der Server host exakt den gleichen Wert für „Domixon. server.host“ haben wie in der Serverkonfiguration. Stellen Sie sicher, dass der Serverhostname die gleiche IP-Adresse auf dem Server als auch dem Client auflöst. Andernfalls würde der Client einen Verbindungsfehler ergeben. Es ist ein weitverbreitetes Konfigurationsproblem, dass der Hostname in unterschiedliche IP-Adressen auf dem Server aufgelöst wird (z.B. zu 127.0.0.1 via internen Netzwerk-Interface), was zu Verbindungsfehlern führt. Es ist immer sicherer eine exakte IP-Adresse sowohl für Server als auch für den Client festzulegen, die man von allen Rechnern am Netzwerk ansteuern kann. Port

Es wird empfohlen die voreingestellten Port-Einstellungen für „Domixon.server.port“ nicht zu ändern, nur wenn es erforderlich ist. Beachten Sie hierfür die obengenannten Hinweise. Die Änderungen können für beide Ports vorgenommen werden. Der konfigurierte Port und der nächste Port werden für die Kommunikation zwischen Server und Client(s) genutzt.

WICHTIG Überprüfen Sie, dass der eingestellte und der nächste Port freigegeben sind für die Nutzung auf dem Server- und dem Clientrechner.

5.4 Akzeptieren von Clientverbindungen Nach dem Einrichten und Starten des Servers wartet der Server auf eingehende Verbindungsanforderungen des Clients.

5.4.1 Verbinden des Clients Starten Sie die Client-Anwendung. Wählen Sie im Fester „Server Manager” die Option “Add New Server”, um die Verbindung zwischen Client und Server einzurichten.

Benennen Sie ihre Verbindung und geben Sie exakt die gleichen Einstellungen für Host und Port ein, die auch für Gebrauchsanleitung

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Benennen Sie ihre Verbindung und geben Sie exakt die gleichen Einstellungen für Host und Port ein, die auch für den Server eingegeben wurden.

Wählen Sie die Serververbindung aus und klicken Sie auf „connect“.

WICHTIG Überprüfen Sie die Firewall-Einstellungen am Serverrechner. Passen Sie die Einstellungen der Firewall so an, dass der Omixon-HLA-Server eingehende Verbindungen akzeptiert.

5.4.2 Exportieren und Importieren von Verbindungskonfigurationen Anstelle einer manuellen Verbindungskonfiguration, kann der Benutzer die Konfigurationsdatei durch das Klicken der “Import configuration“-Schaltflächen auf der „Add New Server“-card im “Server Manager“-Fenster importieren. Die Datei wird vom Systemadministrator bereitgestellt, der die Verbindungseinstellungen in eine Datei exportieren muss. Dazu muss der Administrator im Server-Manager der ausgewählten Verbindung auf „Export“ klicken

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5.5 Der Super-User Der erste Benutzer, der sich registriert, wird standardmäßig automatisch zum Superuser. Das kann später nicht mehr geändert werden, jedoch können andere Benutzer die Rechte eines Superusers erhalten. Es wird empfohlen, dass der Systemadministrator sich zuerst registriert, um die Konfiguration abzuschließen. Der Superuser hat die Erlaubnis neue Accounts zu erstellen und vorhandene Accounts zu verwalten, die via Client zur Anmeldung genutzt werden können. Für weitere Informationen bezüglich Benutzeraufgaben und -berechtigungen lesen Sie bitte im Benutzerhandbuch das Kapitel „User Management“ durch.

5.6 Datenverwaltung Alle Analysen werden von der Serveranwendung durchgeführt und die Ergebnisse auf der Seite des Servers gespeichert. Die Ergebnisse können vom Client angeschaut und exportiert werden. Durchsuchen des Remote-Server-Filesystems bedeutet, dass die Daten nicht über das Netzwerk zwischen Client und Server übermittelt werden müssen, der Auftrag wird sofort bearbeitet.

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